簡并引物設(shè)計

脫氮副球菌染料法熒光定量PCR試劑盒簡并引物常用于從已知蛋白到相關(guān)核酸分子的研究及用于一組引物擴增一類分子。

簡并引物設(shè)計方法
（1）利用NCBI搜索不同物種中同一目的基因的蛋白質(zhì)或cDNA編碼的氨基酸序列 因為密碼子的關(guān)系，不同的核苷酸序列可能表達(dá)的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez檢索系統(tǒng)，查找到一條相關(guān)序列即可。隨后利用這一序列使用BLASTP（通過蛋白查蛋白），在整個NR數(shù)據(jù)庫中查找與之相似的氨基酸序列。
（2）對所有的序列進行多序列比對 將搜索到的同一基因的不同氨基酸序列進行多序列比對， 可選工具有Clustal W/X， 也可在線分析。所有序列的共有部分將會顯示出來。 “*”表示保守， “：”表示次保守。
（3）確定合適的保守區(qū)域 設(shè)計簡并引物至少需要上下游各有一個保守區(qū)域， 且兩個保守區(qū)域相距50~400個氨基酸殘基為宜， 使得PCR產(chǎn)物在150~1200bp之間，重要的是每一個保守區(qū)域至少有6個氨基酸的保守區(qū)，因為每條引物至少18bp左右。

若比對結(jié)果保守性不是很強很可能找不到6個氨基酸序列的保守區(qū)，這時可以根據(jù)物種的親緣關(guān)系，選擇親緣關(guān)系近的物種進行二次比對，若保守性仍達(dá)不到要求，則需進行三次比對，總之，究竟要選多少序列來比對，要根據(jù)前一次的結(jié)果反復(fù)調(diào)整。終目的就是有兩個6個氨基酸且兩者間距離合適的保守區(qū)域。
（4）利用軟件設(shè)計引物 當(dāng)?shù)玫奖Ｊ貐^(qū)域后，就可以利用專業(yè)的軟件來設(shè)計引物了， 其中Primer 5.0 支持簡并引物的設(shè)計， 將參與多序列比對的序列中的任一條導(dǎo)入Primer 5.0 中，將其翻譯成核苷酸序列，該序列群可用一條有簡并性的核苷酸鏈來表示（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C， K=G/T， S=C/G， W=A/C/T， B=C/G/T，V=A/C/G， D=A/G/T， N=A/C/G/T， 該具有簡并性的核苷酸鏈必然包含上一步中找到的氨基酸保守區(qū)域的對應(yīng)部分，在Primer 5.0 中修改參數(shù)，令其在兩個距離合適的保守的nt區(qū)域內(nèi)尋找引物對，總之要保證上下游引物都落在該簡并鏈的保守區(qū)域內(nèi)，結(jié)果會有數(shù)對，分?jǐn)?shù)越高越好。
（5）對引物的修飾 若得到的引物為：
5-NAGSGNGCDTTANCABK-3
則簡并度=4×2×4×3×4×3×2=2304， 很明顯該條引物的簡并度很高不利于PCR， 可以通過次黃嘌呤代替N（因為次黃嘌呤可以很好的和4種堿基配對）和根據(jù)物種密碼子偏好這兩種方法來降低簡并度。
這樣設(shè)計出來的簡并引物對，適用于比對的氨基酸序列所屬物種及與這些物種分類地位相同的其他物種。
脫氮副球菌染料法熒光定量PCR試劑盒簡并引物設(shè)計原則
從蛋白到核酸， 請注意：
（1） 盡量選擇簡并度低的氨基酸區(qū)域為引物設(shè)計區(qū)，如蛋氨酸和色氨酸僅有一個密碼子。
（2） 充分注意物種對密碼子的偏好性，選擇該物種使用頻率高的密碼子，以降低引物的簡并性。
（3） 引物不要終止于簡并堿基，對大多數(shù)氨基酸殘基來說，意味著引物的3末端 不要位于密碼子的第三位。
（4） 在簡并度低的位置，可用次黃嘌呤（dI）代替簡并堿基。
以上幾點遵循的總的原則為： 盡量降低引物的簡并度，尤其在3'末端或近3'末端。