天凈沙單細(xì)胞RNA擴(kuò)增試劑盒
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天凈沙單細(xì)胞RNA擴(kuò)增試劑盒 | 80次 | 詢價(jià) |
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一個(gè)哺乳動(dòng)物單細(xì)胞一般只有約10pg的總RNA,其中的mRNA只有1-5%(約10E5-10E6個(gè)分子),因此直接用單細(xì)胞進(jìn)行mRNA擴(kuò)增具有極大的技術(shù)難度。本公司進(jìn)過精心研究,整合技術(shù),開發(fā)出了可以直接用單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行mRNA擴(kuò)增的試劑盒,本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn):
1. 雙向,既可用于制備正義的mRNA,也可用于制備反義的aRNA(antisense RNA)或cRNA(complimenary RNA)。
2. 直接用單細(xì)胞裂解液進(jìn)行反應(yīng),免RNA提取,整個(gè)過程只需要半天。
3. 適用于多種單細(xì)胞,包括卵細(xì)胞、干細(xì)胞、FACS分離細(xì)胞等單細(xì)胞,還可用于培養(yǎng)細(xì)胞和胚胎等實(shí)體租組織(需要單細(xì)胞化),也可以使用10pg-10ng純化的總RNA作為模板。
4. 假陰性和假陽(yáng)性率均小于6%,RNA擴(kuò)增成功率為90%。
5. 所得mRNA或aRNA(cRNA)可以直接用于后續(xù)的RT-PCR、芯片雜交、表達(dá)譜分析等實(shí)驗(yàn)。
6. 本試劑盒足夠?qū)?0個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞RNA擴(kuò)增。
RNA提取法:試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚,其中異硫氰酸胍可裂解細(xì)胞,促使核蛋白體的解離,使RNA與蛋白質(zhì)分離,并將RNA釋放到溶液中。當(dāng)加入氯時(shí),它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA進(jìn)入水相,離心后可形成水相層和有機(jī)層,這樣RNA與仍留在有機(jī)相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA,有機(jī)層(黃色)主要為DNA和蛋白質(zhì)。
實(shí)驗(yàn)步驟:
1、RNA的提取;
2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;
3、PCR擴(kuò)增;
4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測(cè)定。
RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA,再以cDNA為模板,擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進(jìn)行。在兩步法RT-PCR中,每一步都在zui條件下進(jìn)行。
堿變性提取質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH高達(dá)12.6的堿性條件下,染色體DNA的氫鍵斷裂,雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂,但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)*分離,當(dāng)以pH4.8的NaAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH至中性時(shí),變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來的構(gòu)型,保存在溶液中,而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),通過離心,染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去。
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